常見肉類鑒別技術(shù)研究進展
摘 要：肉類作為我們?nèi)粘Ｊ澄锏闹匾M成部分，其真實性是食品安全的關(guān)鍵問題。近年來，食品安全問題，尤其是市場上各種肉類摻雜、摻假事件，成為人們?nèi)找骊P(guān)注的焦點。嚴格監(jiān)測市場上肉制品，必須要有可靠、簡便、快速的技術(shù)作支撐。本文綜述了現(xiàn)階段常見肉類鑒別技術(shù)的研究進展，并著重描述了聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerasechain reaction, PCR)技術(shù)，因其靈敏度高和特異性高、簡便且耗時少，逐漸成為肉類檢測的實用技術(shù)。
關(guān)鍵詞：肉類檢測；傳統(tǒng)方法；免疫學(xué)技術(shù)；聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)
ATechnological Overview for Identification of Common Meat Species
Abstract: Asmeat is an important part of our daily food, the authenticity of meat is amajor issue of food safty. Recently, more of us have been focused on the issuesof food safety, especially the occurrence of meat products adulteration. Todetect and prevent meat species substitution, a kind of reliable, convenientand rapid technologies must be developed. This paper provides an overview ofthe developed approaches and highlights the DNA-based polymerase chain reaction(PCR) technology. Due to the high sensitivity, specificity and convenient ofPCR assay, as well as its low time-consuming, PCR-based techniques will be thepractical technologies to detect meat and meat products.
Key words: meat species identification；traditional methods；immunological technique；polymerase chain reaction (PCR) technique
近年來，食品安全問題頻發(fā)，食品的衛(wèi)生與安全逐漸成為人們關(guān)注的焦點。我們直擊國內(nèi)的 “老鼠肉、狐貍?cè)狻⑺跞饷俺溲蛉狻笔录ⅰ扒逭嬲信葡碌呢i肉冒充羊肉”、“羊肉卷添加豬肉鴨肉”事件和席卷多國的“馬肉風(fēng)波”以及普遍存在的香腸摻雜摻假等現(xiàn)象……這些與價格、原料和宗教有關(guān)的種種事件，威脅到人們的日常生活和宗教信仰。由此看來，食品安全問題不可小覷，特別是對肉類的鑒別，這需要我們能夠有可靠且可行的方法進行檢測。現(xiàn)階段肉類檢測方法眾多，包括傳統(tǒng)方法與現(xiàn)代方法，經(jīng)典方法與新興方法。本文綜述了肉類鑒別的主要方法，包括傳統(tǒng)感官鑒別、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法以及其它方法。
1 傳統(tǒng)方法
鑒別肉類的傳統(tǒng)方法主要包括視覺、嗅覺、觸覺、味覺等。視覺鑒別指通過對動物肉的酮體、肌肉紋理和顏色、脂肪等直接觀察判斷；嗅覺鑒別指對肉品的氣味判斷鑒別；觸覺鑒別指按壓生肉品，感知肉品的脂肪、肌肉的硬度和彈性來判別；味覺鑒別是通過對肉品經(jīng)加工后的味道來判別。僅僅的感官判別遠不能夠鑒別肉類的真假，可作為輔助手段應(yīng)用。
2 免疫學(xué)方法
免疫學(xué)方法主要包括試管沉淀法、瓊脂擴散法、對流免疫電泳法、放射免疫法、免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linkedimmunosorbnent assay，ELISA)，其中試管沉淀法應(yīng)用較少，ELISA較為常用。馬永征等詳細綜述了以ELISA為主的免疫學(xué)技術(shù)在肉類制品檢測中的研究進展。ELISA用于肉類鑒別的原理是利用抗體對蛋白的識別來區(qū)別肉類品種，包括直接法、間接法、間接競爭法、ABS-ELISA法、組織印記法、捕獲包被法、A蛋白酶聯(lián)法、斑點免疫吸附法和雙抗體夾心法。有人綜述了ELISA技術(shù)在肉類檢測中的應(yīng)用，分析了該技術(shù)廣泛的應(yīng)用前景。利用雙抗夾心ELISA技術(shù)鑒別不同肉類，結(jié)果表明該技術(shù)有較高的敏感性和特異性，并制成商品化診斷盒，以便于有關(guān)部門應(yīng)用。ELISA技術(shù)與傳統(tǒng)鑒別技術(shù)相比，較靈敏可靠，但存在一些弊端，如目標(biāo)分子含量低，各種肉類特異性抗體難以制備且存在交叉反應(yīng)等。
3 分子生物學(xué)技術(shù)
聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chainreaction，PCR)技術(shù)是經(jīng)典的分子生物學(xué)技術(shù)，通過設(shè)計特異性引物，擴增出特定目的DNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離不同大小的DNA片段，以用于鑒別和檢測。PCR技術(shù)用于肉類鑒別，關(guān)鍵在于能夠找到各類物種特異性的基因片段，并設(shè)計引物擴增目的片段。現(xiàn)常用線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），原因在于線粒體DNA比核基因小，為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定且數(shù)量較多，易于進行PCR擴增；2）線粒體DNA比核基因小，自我復(fù)制較快，在一定程度上比核基因進化速度快，導(dǎo)致其存在廣泛的種內(nèi)和種間多態(tài)性，適用于相近物種的鑒別；3）線粒體DNA中某些基因區(qū)域具有高度保守性，可通過設(shè)計通用引物，擴大所鑒別的物種范圍。經(jīng)分析總結(jié)，現(xiàn)階段常用于擴增的線粒體DNA區(qū)域包括細胞色素b（cytochrome b,cyt b）、16SrRNA、12SrRNA、D-loop、ATP6和ATP8等，較少應(yīng)用Myostatin基因 。而本實驗室目前以線粒體基因組為模板設(shè)計引物，并不局限于某個特定區(qū)域，設(shè)計方法比較獨特。現(xiàn)階段國內(nèi)外運用PCR技術(shù)以線粒體基因組作為目的基因鑒別肉類的常見應(yīng)用如表1、表2所示。常用的PCR技術(shù)有常規(guī)PCR、多重PCR(multiplexPCR)、實時熒光定量PCR(real-timefluorescence quantitative PCR，RT-PCR)、限制性片段長度多態(tài)性PCR(restrictionfragment length polymorphism，PCR-RFLP)、隨機擴增多態(tài)性PCR（Random AmplifiedPolymorphic DNA PCR，RAPD-PCR）等。
表1 以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)常見肉類鑒別的國外研究現(xiàn)狀
Table 1 A foreign overview of species identification of common meat by PCR
3.1 常規(guī)PCR
常規(guī)PCR技術(shù)指在PCR反應(yīng)基本組成成分基礎(chǔ)上發(fā)生聚合酶鏈反應(yīng)的技術(shù)，同一體系內(nèi)只有一對引物和單一目的模板，操作簡單、快速。侯東軍等以豬的細胞色素b基因為模板，設(shè)計引物，建立了一種檢測牛羊肉中豬肉成分的方法，省時且特異性高。客觀看來，常規(guī)PCR方法較傳統(tǒng)方法靈敏，特異性高，較免疫學(xué)方法省時，但缺乏對比，需要多組之間相互比較。
3.2 多重PCR(multiplex PCR)
多重PCR指在傳統(tǒng)的常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，于同一體系中加入多對特異性引物，對多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴增出多個目的片段。宗卉 等在PCR體系中同時加入通用引物和牛、羊的特異性引物及牛、羊的mtDNA，建立了多重PCR同時檢測牛、羊源性成分的技術(shù)，特異性高，省時省力。更巧妙的是，等使用多重PCR鑒定了牛、豬、雞、綿羊、山羊和馬 6種肉類，即在線粒體細胞色素b基因上設(shè)計了一條通用的上游引物和各自特異的下游引物，于同一體系中擴增出各自特異的目的片段，并同時得到各種DNA樣品的檢測極限。
值得注意的是，多重PCR技術(shù)可同時加入多對引物，同時擴增幾個DNA片段，前提是每對引物都能在單一PCR體系中應(yīng)用且結(jié)果理想，當(dāng)同時將幾對引物加入一個體系中，需要重新摸索條件。多重PCR反應(yīng)體系的設(shè)計需要考慮到各對引物及模板的濃度、每對引物的溶解溫度和引物之間的相互作用以及目的片段的長度等。建立理想的多重PCR體系可以達到省時、經(jīng)濟、節(jié)約的效果。
3.3 實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitativePCR，RT-PCR)
實時熒光定量PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，根據(jù)熒光信號的強度，利用標(biāo)準曲線、Ct值等對未知模板進行定量分析的方法。RT-PCR技術(shù)中TaqMan RT-PCR技術(shù)和SYBR Green RT-PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛。前者的原理是根據(jù)在PCR擴增時，熒光標(biāo)記探針被降解，發(fā)出熒光信號，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成的完全同步，通過監(jiān)測系統(tǒng)來定量；后者的原理是于SYBR熒光染料特異性地插入到DNA雙鏈之后發(fā)射熒光信號，使得熒光信號與PCR產(chǎn)物同步增加，同樣通過熒光監(jiān)測系統(tǒng)來定量。本實驗室現(xiàn)以馬肉線粒體DNA為模板，設(shè)計出馬的特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)鑒別馬肉及定量肉制品中馬肉含量。
TaqManRT-PCR技術(shù)可用于單一成分的檢測，李林 等應(yīng)用多重實時熒光定量PCR技術(shù)，根據(jù)牛、山羊和綿羊線粒體細胞色素b基因的差異，設(shè)計出特異性的引物和Taqman探針，建立了能夠同時鑒別三者的PCR技術(shù)，并與國標(biāo)方法比對分析，該實驗方法無需電泳、酶切和測序，使得檢測效率提高近3倍，靈敏度比國標(biāo)方法高10倍，適用于檢測肉類、奶品、生皮、飼料和動物油脂等動物產(chǎn)品的牛羊源性成分；該方法還可以用來確定檢測限及定量限，JohnJ. Dooley 等同樣在細胞色素b基因上設(shè)計出特異性引物和熒光探針，建立了適用TaqMan RT-PCR技術(shù)檢測牛肉、豬肉、羊肉、雞肉和火雞肉的方法，且檢測限低于0.1%。Soichi Tanabe ADDIN EN.CITE等在細胞色素b基因上設(shè)計出特異性引物和熒光探針，建立了鑒別食物中微量的豬肉、雞肉、牛肉、羊肉和馬肉的實時熒光定量PCR方法。該方法使定量極限達到100fg/ul，對加工食品中微量肉源檢測有很大的幫助。
SYBRGreen I RT-PCR技術(shù)同樣可用于定量，楊麗霞 等設(shè)計了一對特異性引物，使用SYBR Green I 實時PCR技術(shù)，建立了RT-PCR檢測牛肉中鴨源性成分的檢測方法，檢測靈敏度可達到1pg。該方法比較靈敏，但其存在SYBR Green I熒光染料對DNA雙鏈模板無選擇性等特點，特異性較TaqManRT-PCR差，但成本較TaqManRT-PCR成本低。
總體來說，熒光定量PCR技術(shù)可以在定性的基礎(chǔ)上，達到定量檢測的要求。與其他PCR方法相比，在PCR技術(shù)的高特異性、高靈敏度的基礎(chǔ)上，同時做出定量檢測，簡便可靠，可作為鑒別肉類的實用技術(shù)。
3.4 限制性片段長度多態(tài)性PCR(restriction fragment lengthpolymorphism，PCR-RFLP)
限制性片段長度多態(tài)性PCR技術(shù)，即PCR-RFLP，是PCR技術(shù)和RFLP技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用。該方法通過設(shè)計適當(dāng)?shù)囊铮瑪U增一段含有特定限制性內(nèi)切酶酶切位點的DNA片段，經(jīng)酶切和瓊脂糖凝膠電泳，得到特異性的條帶，以鑒別不同基因型。VioletaFajardo等 詳細綜述了以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的肉源性鑒別，給我們提供了大量PCR-RFLP技術(shù)在肉類鑒別中的研究與應(yīng)用。
PCR-RFLP技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用于肉類真實性的檢測，如馮海永等在線粒體DNA細胞色素b基因上設(shè)計出羊（綿羊、山羊）和鴨的通用引物，擴增出472bp的片段，分別使用限制性內(nèi)切酶SpeI和Bsu36I對羊和鴨的PCR產(chǎn)物進行酶切，分別得到羊（綿羊、山羊）和鴨的特異性片段為213bp和259bp、95bp和377bp，可作為一種對羊肉和鴨肉快速鑒別的簡便可行的方法。該方法也已用于多樣品的檢測，如高林 提取出豬、牛、羊、雞、鴨、兔、魚的生肉DNA和市售的肉源性食品中肉類的DNA，使用線粒體通用引物（Cytb1/Cytb2）進行擴增，并對特異性陽性結(jié)果進行了限制性內(nèi)切酶Mbo I、Alu I、Sau3A I酶切鑒定，結(jié)果表明此種PCR-RFLP方法可準確鑒別制品中相關(guān)肉源性成分。
PCR-RFLP方法較經(jīng)濟，操作簡單易行，尤其適合多樣品的定性研究，較單純的RFLP方法省時、省力。
3.5 隨機擴增多態(tài)性PCR（Random Amplified Polymorphic DNA PCR，RAPD-PCR）
隨機擴增多態(tài)性PCR，即RAPD-PCR，是RAPD技術(shù)與PCR技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用。該技術(shù)以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計一系列（通常數(shù)百個）互不相同的隨機排列堿基順序的寡核苷酸單鏈（通常為10聚體）為引物，對目的基因片段進行PCR擴增，聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離，經(jīng)EB染色或放射自顯影來檢測PCR產(chǎn)物，以觀察DNA片段的多態(tài)性。
PCR-RFLP方法在肉類鑒別中的經(jīng)典應(yīng)用是在1998年Iciar Martinez ADDIN EN.CITE等利用RAPD-PCR技術(shù)成功的鑒別了牛、馬（6個品種）、騾、驢、水牛、麋鹿、馴鹿、豬肉、羊羔、山羊、袋鼠、鴕鳥以及其他肉類，并且實驗得到清晰的DNA指紋圖譜，很容易的辨別出以上樣品。該實驗表明RAPD-PCR技術(shù)不失為是一項簡單、可靠和快速的以DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)。也分別利用物種特異性的DNA指紋圖譜，用此方法鑒定肉制品真實性。
RAPD-PCR技術(shù)可以分析已知和未知物種的DNA多態(tài)性，且對DNA的純度要求不高，但是也存在一些不足，因其所用的引物比一般PCR反應(yīng)短，有時會產(chǎn)生多態(tài)性DNA電泳圖譜，會使實驗結(jié)果分析帶來困難以及實驗重復(fù)性差；圖譜中的弱帶重復(fù)性差，在未標(biāo)準化引物數(shù)目、引物長度和反應(yīng)條件時，結(jié)果不具有可比性；假陽性和假陰性結(jié)果出現(xiàn)率相對較高。
4 其它分析方法
其他肉類鑒別有關(guān)方法包括：a）超聲波技術(shù)，即根據(jù)一些參數(shù)的變化檢測肉類的物理性質(zhì)，如肌肉和脂肪厚度，可用于檢測肉類組成成分 ADDIN EN.CITE 近紅外光譜（nearinfrared，NIR）技術(shù)分析，可用于鑒別肉品種類、產(chǎn)地和真?zhèn)?span style="font-family:'Times New Roman, serif';">，此方法簡便快速且信息量大、無破壞性，但也存在成本高、頻繁維護和改進模型等不理想的方面。這兩種技術(shù)均無需對肉品進行破壞，且樣品能夠反復(fù)利用，可稱為無損檢測技術(shù)。
